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Tipo de Mídia:
Texto
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Formato:
.pdf
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Tamanho:
11,85
MB
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Título: |
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Defensinas de sementes de feijao: purificacao, clonagem molecular, expressao heterologa e atividade biologica |
Autor: |
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Izabela Silva dos Santos
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Categoria: |
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Teses e Dissertações |
Idioma: |
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Português |
Instituição:/Parceiro |
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[cp] Programas de Pós-graduação da CAPES
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Instituição:/Programa |
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UENF/BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA |
Área Conhecimento |
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MICROBIOLOGIA |
Nível |
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Doutorado
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Ano da Tese |
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2009 |
Acessos: |
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894 |
Resumo |
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Defensinas de plantas são peptídeos básicos, ricos em cisteína, que estão amplamente distribuídos nos organismos vivos. Em plantas, são componentes importantes da imunidade inata e têm sido descritas em diferentes órgãos, incluindo as sementes. A primeira parte deste trabalho mostra a purificação e a expressão funcional de uma defensina de sementes de feijão-de-corda e a descrição de sua atividade inibitória contra α,-amilase. A defensina de sementes de feijão-de-corda foi purificada de acordo com a metodologia descrita por Carvalho et al. (2001), com modificações. Após purificação, esta defensina foi submetida a ensaio de inibição da atividade de α,-amilase e se mostrou capaz de inibir as α,-amilases dos insetos Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus. O fragmento que codifica a defensina de sementes de feijão-de-corda foi clonado no vetor pET EK/LIC e a construção de DNA resultante foi usada para transformação bacteriana. O peptídeo recombinante foi purificado através de cromatografia de afinidade em coluna de Ni Sepharose e cromatografia de fase reversa em coluna C2/C18 em HPLC. O sequenciamento N-terminal do peptídeo recombinante mostrou que este possui a sequência bastante similar à seqüência da defensina isolada a partir das sementes. Ensaio de inibição da atividade α,-amilasica mostrou que a defensina recombinante também inibe a α,-amilase de C. maculatus. As defensinas isoladas não inibem a α,-amilase salivar de humanos. A estrutura tridimensional da defensina recombinante foi modelada e a estrutura resultante é similar às estruturas de outras defensinas de plantas já caracterizadas. Na segunda parte deste trabalho, é apresentada a clonagem molecular e a atividade antifúngica de uma defensina de sementes de feijão comum. A seqüência N-terminal da defensina madura isolada de sementes de feijão comum foi usada para produzir um iniciador degenerado. Este iniciador permitiu a amplificação do cDNA da defensina por RT-PCR a partir do mRNA de sementes de P. vulgaris. Análise da sequência do cDNA clonado, nomeado PVD1, demonstrou que 314 bp codificam um polipeptídeo de 47 resíduos de aminoácidos. A seqüência deduzida do peptídeo apresenta grande similaridade com defensinas de Cicer arietinum (95%), Vigna radiata (93%) e Pachyrhizus erosus (87%). A defensina de sementes de feijão comum foi purificada através de cromatografias de troca iônica e de fase reversa e posteriormente submetida a análise da sua atividade antifúngica. Esta defensina inibiu o crescimento das leveduras Candida albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. guilliermondii, Kluyveromyces marxiannus e Saccharomyces cerevisiae, além de causar alterações na morfologia destas células. Ensaio de captação de SYTOX Green revelou que esta defensina ainda é capaz de permeabilizar a membrana de S. cerevisiae. Análises da ultra-estrutura de células de C. albicans e C. guilliermondii tratadas com a defensina de sementes de feijão comum revelaram desorganização do conteúdo citoplasmático e da membrana plasmática. |
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