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Tipo de Mídia:
Texto
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Formato:
.pdf
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Tamanho:
6,49
MB
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Título: |
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Internalização e tráfego de PrPs |
Autor: |
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Ana Cristina Ribeiro Magalhães
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Categoria: |
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Teses e Dissertações |
Idioma: |
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Português |
Instituição:/Parceiro |
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[cp] Programas de Pós-graduação da CAPES
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Instituição:/Programa |
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UFMG/FARMACOLOGIA BIOQUIMICA E MOLECULAR |
Área Conhecimento |
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FARMACOLOGIA |
Nível |
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Doutorado
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Ano da Tese |
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2005 |
Acessos: |
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359 |
Resumo |
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A proteína prion celular (PrPsen ou PrPc) é uma proteína expressa em vários tipos
celulares, especialmente em neurônios. Esta proteína apresenta uma estrutura rica em
alfa hélices, no entanto pode sofrer uma mudança de conformação secundária gerando
uma isoforma conhecida como PrPres (ou PrPsc). Esta isoforma apresenta uma estrutura
predominante de folhas beta e adquire a capacidade de se associar formando amilóides,
bem como resistência a tratamento com proteases. Através de um mecanismo biológico
ainda pouco esclarecido, PrPres é capaz de promover a conversão de moléculas de
PrPsen para PrPres. A formação e deposição de agregados insolúveis de PrPres no
sistema nervoso estão relacionados a uma série de doenças neurodegenerativas raras e
fatais.
A internalização e tráfego intracelular destas isoformas podem revelar informações
importantes sobre o papel fisiológico de PrPsen, bem como os mecanismos de infecção
e propagação de PrPres entre células. Interessados nestes mecanismos, nosso grupo
construiu uma versão da proteína prion celular ligada a “green fluorescent protein”
(GFP) para monitorarmos a distribuição, endocitose e tráfego desta proteína em células
neuronais SN56 vivas. Células SN56 expressando esta proteína de fusão (GFP-PrPc)
apresentaram a fluorescência distribuída pela membrana plasmática e em
compartimentos intracelulares próximos ao núcleo, de maneira similar a proteína
endógena. GFP-PrPc foi internalizada e direcionada para uma região perinuclear na
presença de cobre, indicando um papel importante deste íon na fisiologia de PrPc. Um
mutante de deleção N-terminal (aminoácidos 32 a 121) ligado a GFP apresentou maior
acúmulo na membrana plasmática e menor concentração na região perinuclear,
sugerindo uma deficiência na endocitose. Além disso, o cobre não foi capaz de induzir a
endocitose deste mutante, indicando que a região N-terminal é importante para a
endocitose constitutiva e induzida por cobre de PrPc. Experimentos de dupla marcação
indicaram que a região perinuclear positiva para GFP-PrPc era constituída de
endossomas de reciclagem e Golgi.
O mecanismo de endocitose de GFP-PrPc também foi avaliado e a endocitose
constitutiva e induzida por cobre de GFP-PrPc foi dependente de dinamina I. Células
expressando o fragmento C terminal da proteína AP180, que compete com a proteína
endógena responsável pelo recrutamento de clatrina para a membrana plasmática,
xiii
apresentam 75% de inibição da endocitose dependente de clatrina. Nestas células, a
endocitose constitutiva de GFP-PrPc não sofreu alteração e a induzida por cobre
apresentou uma inibição parcial, sugerindo que o mecanismo de endocitose de GFP-
PrPc é complexo, podendo envolver tanto um mecanismo dependente como
independente de clatrina. Provavelmente, o mecanismo independente não envolve
caveolae, já que não pudemos detectar caveolina, um marcador para caveolae, em
células SN56.
Nós também avaliamos a internalização e tráfego de PrPres usando diferentes cepas
de PrPres conjugadas à molécula fluorescente alexa568. Células SN56 foram capazes de
processar agregados da cepa de PrPres Chandler de camundongo distribuindo a
fluorescência em vesículas espalhadas pelo citoplasma e neuritos. Outras cepas de
PrPres, 263K e 87V, não foram processadas e internalizadas com a mesma eficiência
em células SN56. As células incubadas com Chandler PrPres foram capazes de produzir
novas moléculas de PrPres, indicando que estavam infectadas persistentemente,
enquanto as cepas 263K e 87V não foram capazes de infectar estas células. Estes dados
mostram que a endocitose e tráfego de PrPres foram coincidentes com a infecção das
células, sugerindo que as vias utilizadas por PrPres para internalizar e trafegar na célula
podem ter importância neste processo.
As vesículas de Chandler PrPres colocalizaram com marcadores para endossomas
tardios e lisossomas (dextran e lisotracker) e não colocalizaram com marcadores da via
clássica de clatrina (transferrina) ou vesículas provenientes de endocitose por “lipid
rafts” (toxina da cólera) indicando que após internalização provavelmente por um
mecanismo independente de clatrina ou “rafts”, Chandler PrPres é direcionado para
organelas acídicas. A expressão do mutante constitutivamente ativo de Rab 7 (GFP-
Rab7 Q67L) confirmou que PrPres está presente em endossomas tardios e lisossomas
no corpo e neuritos. Em neuritos, Chandler PrPres não colocalizou com GFP-VAChT,
um marcador de vesículas sinápticas. Experimentos com outra linhagem celular (N2a)
persistentemente infectada por PrPres indicaram alteração na formação de PrPres na
presença de mutantes de Rab 7... |
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