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Título:  
  Caracterização molecular e bioquímica da cisteíno protease majoritária do trypanosoma brucei brucei, brucipaína
Autor:  
  Tatiana Ferreira Rocha Costa   Listar as obras deste autor
Categoria:  
  Teses e Dissertações
Idioma:  
  Português
Instituição:/Parceiro  
  [cp] Programas de Pós-graduação da CAPES   Ir para a página desta Instituição
Instituição:/Programa  
  UFRJ/CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA)
Área Conhecimento  
  BIOFÍSICA
Nível  
  Mestrado
Ano da Tese  
  2006
Acessos:  
  214
Resumo  
  Cisteíno proteases (CPs) da superfamília da papaína de protozoários patogênicos são importantes para sua sobrevivência e sua interação com o hospedeiro. Inibidores irreversíveis sintéticos de CPs são capazes de matar o tripanosomatídeo africano, Trypanosoma brucei, quando adicionado ao meio de cultura de formas procíclicas. Embora diferentes inibidores de CPs afetam significativamente a sobrevivência do T. brucei brucei, a brucipaína, cisteíno protese majoritária deste protozoário, ainda não foi caracterizada em detalhe. Neste estudo, descrevemos a expressão da forma recombinante da CP do T. brucei brucei (brucipaína) e a caracterização de suas propriedades bioquímicas. O gene que codifica a brucipaína foi clonado amplificado por PCR utilizando oligonucleotídeos baseados na sequência da rodesaína, congopaína e CP T.brucei. O fragmento abrangendo os domínios pró e central foi incorporado a uma cauda de poli-histidina e introduzido em E.coli para expressão. A próbrucipaína recombinante foi expressa como corpos de inclusão, foi purificada em coluna de afinidade e renovelada in vitro. A enzima madura foi obtida por auto-maturação na presença de agentes redutores e posteriormente purificada em coluna de Thio-propyl sefarose. A brucipaína hidrolisa o subtrato Z-Phe-Arg-MCA, mas é inibida quando ensaiada com este substrato com concentrações acima de 5 μM no meio reacional, à temperatura ambiente. A inibição por substrato não foi observada quando a enzima foi ensaiada a 37oC. A brucipaína não hidrolisa o substrato Z-Arg-Arg-MCA, como previsto pela presença do resíduo Ala na posição 205 do subsítio S2 da enzima. A caracterização da especificidade de substrato foi realizada utilizando substratos polipeptídicos sintéticos que contêm 7 resíduos de aminoácidos com variações sistemáticas nas posições P2-P1’. Os resultados demonstraram que a brucipaína difere da cruzaína, CP majoritária do T. cruzi, em relação aos principais subsítios determinantes de specificidade (S’1, S1 and S2). Além disso, verificamos que a atividade catalítica da brucipaína pode ser regulada por glicosaminoglicanos, que promovem alterações nos parâmetros cinéticos da enzima. Também determinamos as constantes de inativação da brucipaína pelos inibidores E-64, prodomínio recombinante da cruzipaína, TbICP, cistatina C humana recombinante e vinilsulfonas.
     
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