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Tipo de Mídia:
Texto
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Formato:
.pdf
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Tamanho:
676.01
KB
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Título: |
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Caracterização molecular e bioquímica da cisteíno protease majoritária do trypanosoma brucei brucei, brucipaína |
Autor: |
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Tatiana Ferreira Rocha Costa
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Categoria: |
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Teses e Dissertações |
Idioma: |
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Português |
Instituição:/Parceiro |
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[cp] Programas de Pós-graduação da CAPES
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Instituição:/Programa |
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UFRJ/CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA) |
Área Conhecimento |
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BIOFÍSICA |
Nível |
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Mestrado
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Ano da Tese |
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2006 |
Acessos: |
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214 |
Resumo |
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Cisteíno proteases (CPs) da superfamília da papaína de protozoários patogênicos são
importantes para sua sobrevivência e sua interação com o hospedeiro. Inibidores irreversíveis
sintéticos de CPs são capazes de matar o tripanosomatídeo africano, Trypanosoma brucei,
quando adicionado ao meio de cultura de formas procíclicas. Embora diferentes inibidores de
CPs afetam significativamente a sobrevivência do T. brucei brucei, a brucipaína, cisteíno
protese majoritária deste protozoário, ainda não foi caracterizada em detalhe. Neste estudo,
descrevemos a expressão da forma recombinante da CP do T. brucei brucei (brucipaína) e a
caracterização de suas propriedades bioquímicas. O gene que codifica a brucipaína foi
clonado amplificado por PCR utilizando oligonucleotídeos baseados na sequência da
rodesaína, congopaína e CP T.brucei. O fragmento abrangendo os domínios pró e central foi
incorporado a uma cauda de poli-histidina e introduzido em E.coli para expressão. A próbrucipaína
recombinante foi expressa como corpos de inclusão, foi purificada em coluna de
afinidade e renovelada in vitro. A enzima madura foi obtida por auto-maturação na presença
de agentes redutores e posteriormente purificada em coluna de Thio-propyl sefarose. A
brucipaína hidrolisa o subtrato Z-Phe-Arg-MCA, mas é inibida quando ensaiada com este
substrato com concentrações acima de 5 μM no meio reacional, à temperatura ambiente. A
inibição por substrato não foi observada quando a enzima foi ensaiada a 37oC. A brucipaína
não hidrolisa o substrato Z-Arg-Arg-MCA, como previsto pela presença do resíduo Ala na
posição 205 do subsítio S2 da enzima. A caracterização da especificidade de substrato foi
realizada utilizando substratos polipeptídicos sintéticos que contêm 7 resíduos de
aminoácidos com variações sistemáticas nas posições P2-P1. Os resultados demonstraram
que a brucipaína difere da cruzaína, CP majoritária do T. cruzi, em relação aos principais
subsítios determinantes de specificidade (S1, S1 and S2). Além disso, verificamos que a
atividade catalítica da brucipaína pode ser regulada por glicosaminoglicanos, que promovem
alterações nos parâmetros cinéticos da enzima. Também determinamos as constantes de
inativação da brucipaína pelos inibidores E-64, prodomínio recombinante da cruzipaína,
TbICP, cistatina C humana recombinante e vinilsulfonas. |
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