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Título:  
  Caracterização estrutural e funcional da proteína HFQ de Herbaspirillum seropedicae
Autor:  
  Marco Antonio Seiki Kadowaki   Listar as obras deste autor
Categoria:  
  Teses e Dissertações
Idioma:  
  Português
Instituição:/Parceiro  
  [cp] Programas de Pós-graduação da CAPES   Ir para a página desta Instituição
Instituição:/Programa  
  UFPR/CIÊNCIAS (BIOQUÍMICA)
Área Conhecimento  
  BIOQUÍMICA
Nível  
  Mestrado
Ano da Tese  
  2008
Acessos:  
  609
Resumo  
  A proteína Hfq, considerada pleiotrópica e com função de chaperona de RNA, tem sido amplamente estudada devido a sua importância na regulação póstranscricional em várias bactérias. Neste trabalho foram caracterizados o gene e a proteína Hfq de Herbaspirillum seropedicae, uma bactéria diazotrófica que se associa a importantes culturas agrícolas. O gene hfq foi amplificado a partir do DNA genômico de H. seropedicae e clonado nos vetores de expressão pT7-7 e pET28(a), resultando nos plasmídeos pKADO1 e pKADO2 que permitiram expressar a proteína nas suas formas nativa e fusionada a cauda de histidinas respectivamente. A proteína Hfq foi purificada por cromatografia de afinidade (forma fusionada) usando a coluna Hitrap-chelating Ni-2 ou pelas cromatografias de interação hidrofóbica e troca aniônica (forma nativa) usando as colunas butil-Sepharose e DEAE-Sepharose respectivamente. A proteína Hfq-His foi purificada com 90 % de pureza final e a nativa alcançou 99 % de pureza. As duas formas da proteína Hfq apresentaram atividade de ligação ao sRNA DsrA de Escherichia coli quando analisadas em ensaios de retardamento de banda. A proteína nativa apresentou uma maior afinidade pelo sRNA do que a forma fusionada, sugerindo uma possível alteração da conformação do oligômero devido a presença da cauda de histidinas. Hfq foi também analisada através das técnicas de dicroísmo circular (CD) e espalhamento de luz dinâmico (DLS). O espectro de CD na região de UV distante indicou a predominância de fitas beta em relação aos demais tipos de estrutura secundária como já reportado na literatura para a Hfq de outros microrganismos. O experimento de DLS mostrou uma amostra monodispersa com 48 kDa, dado indicativo de uma conformação hexamérica final que foi confirmada por experimentos de gelfiltração. Ensaios de cristalização automatizada por difusão de vapor em gota sentada resultaram na formação de cristais em diversas condições, após três dias. A difração por raios-X, utilizando um gerador de raios-X Rigaku, confirmou a presença de vários cristais constituídos de proteínas. Uma das condições de cristalização, 100 mM de PCB pH 7,0 e 25 % (w/v) PEG1500, permitiu a formação de um cristal que difratou a uma resolução de 2.7 Å.
     
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