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Tipo de Mídia:
Texto
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Formato:
.pdf
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Tamanho:
2,44
MB
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Título: |
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Caracterização estrutural e funcional da proteína HFQ de Herbaspirillum seropedicae |
Autor: |
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Marco Antonio Seiki Kadowaki
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Categoria: |
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Teses e Dissertações |
Idioma: |
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Português |
Instituição:/Parceiro |
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[cp] Programas de Pós-graduação da CAPES
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Instituição:/Programa |
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UFPR/CIÊNCIAS (BIOQUÍMICA) |
Área Conhecimento |
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BIOQUÍMICA |
Nível |
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Mestrado
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Ano da Tese |
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2008 |
Acessos: |
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1.053 |
Resumo |
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A proteína Hfq, considerada pleiotrópica e com função de chaperona de RNA,
tem sido amplamente estudada devido a sua importância na regulação póstranscricional
em várias bactérias. Neste trabalho foram caracterizados o gene e a
proteína Hfq de Herbaspirillum seropedicae, uma bactéria diazotrófica que se associa a
importantes culturas agrícolas. O gene hfq foi amplificado a partir do DNA genômico de
H. seropedicae e clonado nos vetores de expressão pT7-7 e pET28(a), resultando nos
plasmídeos pKADO1 e pKADO2 que permitiram expressar a proteína nas suas formas
nativa e fusionada a cauda de histidinas respectivamente. A proteína Hfq foi purificada
por cromatografia de afinidade (forma fusionada) usando a coluna Hitrap-chelating Ni-2
ou pelas cromatografias de interação hidrofóbica e troca aniônica (forma nativa) usando
as colunas butil-Sepharose e DEAE-Sepharose respectivamente. A proteína Hfq-His foi
purificada com 90 % de pureza final e a nativa alcançou 99 % de pureza. As duas
formas da proteína Hfq apresentaram atividade de ligação ao sRNA DsrA de
Escherichia coli quando analisadas em ensaios de retardamento de banda. A proteína
nativa apresentou uma maior afinidade pelo sRNA do que a forma fusionada, sugerindo
uma possível alteração da conformação do oligômero devido a presença da cauda de
histidinas. Hfq foi também analisada através das técnicas de dicroísmo circular (CD) e
espalhamento de luz dinâmico (DLS). O espectro de CD na região de UV distante
indicou a predominância de fitas beta em relação aos demais tipos de estrutura
secundária como já reportado na literatura para a Hfq de outros microrganismos. O
experimento de DLS mostrou uma amostra monodispersa com 48 kDa, dado indicativo
de uma conformação hexamérica final que foi confirmada por experimentos de gelfiltração.
Ensaios de cristalização automatizada por difusão de vapor em gota sentada
resultaram na formação de cristais em diversas condições, após três dias. A difração
por raios-X, utilizando um gerador de raios-X Rigaku, confirmou a presença de vários
cristais constituídos de proteínas. Uma das condições de cristalização, 100 mM de PCB
pH 7,0 e 25 % (w/v) PEG1500, permitiu a formação de um cristal que difratou a uma
resolução de 2.7 Å. |
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